Pomimo tylu tak zaszczytnych godności kardynał Michał Ghislieri wyróżniał się nadal niezwykłą prostotą i stylem życia. Po pewnym czasie jednak naraził się papieżowi. Paweł IV był bowiem zwolennikiem rządów twardych i na punkcie prawowierności był nieubłagany. Polecił inkwizytorom, by wobec podejrzanych o sprzyjanie nowinkom byli bezwzględni. Nie można się temu dziwić, gdyż głoszone błędy znajdowały wielu zwolenników także wśród hierarchii kościelnej. Kardynał Ghislieri był natomiast zwolennikiem taktyki przekonywania, upominania i jak najłagodniejszych kar. Dzięki temu uwolnił od podejrzenia o herezję kardynała Morone i uwolnił z więzienia arcybiskupa Toledo, Bartłomieja Carranza, podejrzanego również o sprzyjanie herezji. Na wiadomość o tym surowy papież wypominał kard. Ghislieri, że przez swą zbytnią łagodność rozzuchwala błędnowierców. Doszło do tego, że wyrzucał mu wprost, że jest niegodnym kardynalskiej purpury, groził mu nawet uwięzieniem w Zamku Anioła (1559).
Następca Pawła IV, Pius IV zwolnił kard. Ghislieri z urzędu naczelnego inkwizytora i przeniósł go z Rzymu na biskupstwo Mondovi w Piemoncie (1560). Okazało się, że także do jego diecezji dotarły "nowinki" heretyckie. Gorliwy biskup starał się wszelkimi sposobami pozyskać odpadłych od Kościoła. Unikał przy tym środków represyjnych.
9 grudnia 1565 roku zmarł papież Pius IV. Kardynałowie, na wniosek św. Karola Boromeusza, 7 stycznia 1566 roku wybrali jego następcą kardynała Ghislieri. Nowy papież przybrał sobie imię Piusa V. Koronacja odbyła się 17 stycznia, w sam dzień urodzin papieża. Miał on wtedy 62 lata.
Pius V od razu przystąpił do wprowadzania w życie uchwał zakończonego 3 lata wcześniej Soboru Trydenckiego. Zwracał baczną uwagę, by do urzędów kościelnych dopuszczać tylko najgodniejszych. Odrzucał stanowczo względy rodzinne, dyplomatyczne czy też polityczne. Przeprowadził do końca reformę w kurii rzymskiej: w Datarii, Sygnaturze, w Kamerze i w Kancelarii Papieskiej. Zaprowadził także ład w poszczególnych kongregacjach rzymskich i wprowadził kongregacje nowe, jak na przykład kongregację interpretacji uchwał Soboru Trydenckiego i kongregację indeksu. Wprowadził zakaz opuszczania na dłuższy czas przez biskupów diecezji i parafii przez proboszczów. Nakazał biskupom odbywanie regularnych wizytacji parafii. Dla podniesienia studiów i poziomu moralnego kleru państwa watykańskiego nakazał, by klerycy odbywali studia w Kolegium Rzymskim, które zostało powierzone jezuitom. Nalegał niemniej stanowczo, by każda diecezja miała seminarium dla swoich kleryków. Wyznaczył wizytatorów apostolskich, którzy mieli dopilnować, aby uchwały Soboru były przeprowadzone we wszystkich krajach. Jednym z pierwszych posunięć nowego papieża było uzupełnienie kolegium kardynalskiego o ludzi prawych i całkowicie oddanych sprawie Kościoła.
W swoich wysiłkach dla przeprowadzenia reformy nie pominął papież także zakonów. Kiedy humiliaci nie chcieli poddać się zarządzeniom papieskim, zostali zniesieni dekretem w 1571 roku.
Dla pozyskania prawosławnych Greków Pius V wyniósł do godności doktorów Kościoła czterech przedstawicieli Kościoła wschodniego: św. Bazylego, św. Grzegorza z Nazjanu, św. Grzegorza z Nyssy i św. Jana Złotoustego. Wprowadził też ich imiona do liturgii łacińskiej na wzór czterech wielkich doktorów w Kościele zachodnim, którymi byli: św. Ambroży, św. Hieronim, św. Augustyn i św. Grzegorz I Wielki. Do grona doktorów, czyli nauczycieli Kościoła, dołączył w 1567 r. także swojego współbrata zakonnego, św. Tomasza z Akwinu (z tytułem Doktora Anielskiego) i zarządził wydanie drukiem jego dzieł, a także wprowadził je do programów seminaryjnych.
Katechezie katolickiej przysłużył się przez zainicjowanie i ogłoszenie Katechizmu Rzymskiego (1566), który miał być dla proboszczów podstawą do wykładu wiary. Zasługą Piusa V była także reforma brewiarza (1568) i mszału (1570). Dla ujednolicenia liturgii łacińskiej papież zniósł zbyt daleko idące na tym polu przywileje liturgii partykularnych kościołów czy też zakonów. Inkwizytorom nakazał stosować wielką roztropność i umiar. Wystąpił stanowczo przeciwko inkwizycji hiszpańskiej, która nie miała nic wspólnego z obroną wiary, a służyła wyłącznie celom politycznym króla Filipa II.
Tak wszechstronnie zaplanowana i konsekwentnie przeprowadzona reforma Kościoła zaczęła bardzo szybko wydawać błogosławione owoce religijnego odrodzenia.

Papież starał się zaprowadzić ład także w państwie kościelnym. Raz w miesiącu osobiście przyjmował zażalenia na wyroki sądów i urzędników papieskich i rozstrzygał je na korzyść poszkodowanych. Dwa razy w tygodniu przyjmował skargi ubogich. W owym czasie rozwinął się bardzo w państwie kościelnym bandytyzm. Pius V ścigał przestępców z całą surowością, aż zaprowadził wreszcie upragniony spokój. Wystawił wiele szkół, szpitali i przytułków. Uzdrowił administrację w państwie kościelnym i rozkładał sprawiedliwie podatki. Cenił bardzo modlitwę różańcową i propagował ją wśród duchowieństwa i ludu. W 1569 r. specjalnym dokumentem nadał różańcowi formę, która przetrwała aż do naszych czasów.
Za jego pontyfikatu książę Juan de Austria, nieślubny syn cesarza Karola V, wystąpił przeciwko Turkom podczas jednej z najkrwawszych bitew morskich pod Lepanto. Zjednoczona flota chrześcijańska odniosła 7 października 1571 roku wspaniałe zwycięstwo. Z 250 galer tureckich 60 zostało zatopionych lub dostało się do niewoli. Z armii tureckiej, liczącej 75 tys. doborowego żołnierza 27 tys. zatonęło, a 5 tys. dostało się do niewoli. Straty chrześcijańskie wyniosły: 12 zatopionych galer i 8 tys. zabitych. Na wieść o zbliżającej się wojnie papież, dominikanin i wielki czciciel Matki Bożej, rozpoczął żarliwe odmawianie modlitwy różańcowej w intencji powstrzymania islamizacji Starego Kontynentu. Po zwycięstwie przypisał je wstawiennictwu Najświętszej Marii Panny Różańcowej i ustanowił w tym dniu jej święto (początkowo obchodzone tylko w kościołach, przy których były Bractwa Różańcowe).
W rok po tym zwycięstwie ciężko zachorował na nerki. Zaopatrzony ostatnimi sakramentami świętymi, ubrany w habit dominikański modlił się: "Panie, powiększaj moje cierpienia, ale z nimi powiększaj cierpliwość". Zmarł 1 maja 1572 roku w wieku 68 lat. Zaraz po śmierci otoczyła go cześć ludu. Na ołtarze wyniósł go w chwale błogosławionych dopiero papież Klemens X w roku 1672. Kanonizował go zaś papież Klemens XI 22 maja 1712 r. Jego ciało spoczywa w Rzymie, w bazylice Santa Maria Maggiore. Jest patronem Kongregacji Nauki Wiary. Pontyfikat Piusa V to początek białej sutanny papieży. Zaczerpnięty z dominikańskiego habitu kolor sutanny do dziś używany jest przez biskupów Rzymu.